（1）患者在病房清潔、消毒手術部位后，換上經消毒的衣服、褲子并戴帽子至手術室。
（2）使用手術室對接車接送。無對接車者，在手術室入口處將患者換到手術室經清潔處理過的平車上。車輪通過粘附墊吸塵處理后推入手術間。
（3）皮膚消毒:為使手術部位的皮膚達到較寬的殺菌范圍，應采用兩種或兩種以上的混合消毒液消毒。
（4）鋪無菌草:無菌單應采用不利于細菌生存的非織物材料。鋪無菌單時應根據手術室空氣流動方向采用不同方式:垂直層流手術間鋪置的無菌單應垂直地板，如不垂于地板，就會引起空氣紊流，使污染物質從地板掀起;水平層流間手術鋪置地無菌單，垂在手術臺前后端的部分不應超過手術臺至地面距離的1/3。如果垂至地板，就會引起空氣紊流，使污染物質從地板飛揚起來。而在手術臺兩側的無菌單是可以垂至地板的。
（5）限制在手術臺上翻動。如確實有必要翻動蓋單時，應盡可能輕柔，以免帶菌飄浮物沉降于無菌手術區內。
為了保證設備的正常運，醫院應制定層流手術室設備運行管理制度。設專人每天檢查控制板上空調顯示數據，定期檢測空調系統運行情況，嚴格遵守管理規范，做好維護保養工作。
層流手術室急診手術間的送風系統，應24小時維持在低速運行狀態，以保證手術室恒溫、恒濕和潔凈度。其他手術間可根據實際情況，在手術前1小時將層流打開維持低速運行狀態，手術前30～40分鐘調至高速運行。
對長時間沒有使用的手術間，啟用時應首先清潔送風口濾網，并至少提前3小時開機運行，以達到手術室空氣潔凈度要求。適宜的溫度、濕度使術者心情穩定，也有利于患者術后傷口的愈合。室溫過高，工作人員容易出汗，影響操作并可能增加的機會；室溫過低，患者易發生低溫功能障礙影響術后恢復。
據資料介紹：相對濕度低于50%，可能產生靜電火花；濕度過高，超過60%以上時，空氣培養即可出現真菌生長繁殖。因此應按規定將手術室內溫度控制在22～25℃，濕度控制在40％～60％之間。冬季因空調影響，需要適當加濕，對溫度濕度的調控應該更加注意。層流手術室在運行過程中的安全管理工作，是應該注意的重點。手術室的消防器材、安全通道要設臵醒目的標志，工作人員要熟悉其位臵和使用方法。
手術室空氣中的細菌可來自室內一切物體及各類人員體表，因此進入手術室的工作人員，必須按要求著裝，通過風淋室后，才能進入手術室。手術的術前處理應在病房準備完畢，清潔消毒手術部位后，換上消毒的病員服和帽子，由手術對接車送至手術室。手術室所備的衣褲、鞋、帽、口罩等離開時應將其放在位臵。服裝應選用不易產生靜電、不易脫落纖維的織物。手術室內的人員數量應保持在限度，以防止紊生。
層流手術室空氣潔凈度與手術空間的相對密閉狀態密切相關，進出手術室的人越多，室內空氣污染就越重。有資料顯示當每臺手術人員進出累積達到60人次時，空氣中細菌的含量就會超標，從而增加發生的機會，因此要嚴格控制手術室人員的進出，減少手術室開門次數與時間。根據手術室大小嚴格控制人數，參觀者進人手術室后應限制在區域內，與手術野至少保持1米的距離，不得任意穿行或互串手術間。
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